Vor der Markteinführung müssen Arzneimittel und Medizinprodukte auf die Sicherheit für den menschlichen Gebrauch überprüft werden und frei von bakteriellen Endotoxinen sein. Gelangen diese Zellmembran-Bestandteile gramnegativer Bakterien in Kontakt mit der Blutbahn von Mensch oder Tier, können sie schweres Fieber auslösen, das gerade bei geschwächten Patienten tödlich verlaufen kann.
Endotoxine – das sind Bestandteile der Zellmembran gramnegativer Bakterien – sind äusserst hitzestabil, widerstehen vielen gängigen Sterilisationsmethoden und benötigen auch keine lebensfähigen Bakterien für ihre Aktivität. Gelangen sie beispielsweise über Nadeln oder Infusionssäcke in den Blutkreislauf von Mensch und Tier, reagieren diese schnell mit Immunzellen und lösen eine starke Entzündungsreaktion mit Fieber aus. Insbesondere bei geschwächten Personen oder Dialysepatienten kann dies sogar zum Tod führen.
Ein Gel aus der Natur
Der atlantische Pfeilschwanzkrebs (Limulus polyphemus) besitzt ein spezielles Immunsystem: Kommt das blaue Blut der Urzeitkrebse mit selbst kleinsten Mengen an Endotoxin in Kontakt, wird als Immunantwort ein Gel um das Pathogen herum gebildet, das eine weitere Infektion der verletzten Stelle verhindern soll. Dafür sorgt ein spezieller Faktor im Blut der Tiere, der als Grundlage für den Bakterien-Endotoxin-Test (BET) beziehungsweise den Limulus-Amöbozyten-Lysat-(LAL)-Test dient. Dieser wird im Rahmen der Chargenfreigabeprüfung für Medizinprodukte und Arzneimittel mit Kontakt zum Herz-Kreislauf-System und zum Lymphsystem durchgeführt. Der Gerinnungsfaktor aus den Blutzellen (Amöbozyten) der Pfeilschwanzkrebse wird den Tieren auf nachhaltige Weise entnommen. Die Tiere sind markiert, so dass ein und demselben Tier nur eine kleine Menge in grossen Abständen entzogen wird. Darüber hinaus werden sie regelmässig medizinisch untersucht und innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Entnahme der Blutproben wieder an ihren angestammten Lebensort gebracht. Zum Schutz der Tiere hat sich das Unternehmen Fujifilm Wako zudem mehreren Organisationen, unter anderem dem «Horseshoe Crab Conversation Fund» und dem «US Fish and Wildlife Service» angeschlossen.
Kontamination ausschliessen
«Pharmazeutische Produkte können während der Reinigungs-, Produktions- oder Verpackungsphasen kontaminiert werden, etwa durch ungenügende Reinigung der Prozessanlagen oder bereits kontaminierte Rohmaterialien wie Reagenzwasser», berichtet Dr. Vi Tran, Product Manager Laboratory Chemicals bei der Fujifilm Wako Chemicals Europe GmbH. «Mit dem Test soll eine Kontamination vor der Anwendung bei Mensch und Tier ausgeschlossen werden.»
Ohne falsch-positives Ergebnis
Jedoch reagieren unbehandelte LAL-Reagenzien ebenso mit Pilzzellwandbestandteilen – genauer: mit (1→3) β-D-Glucan (Beta-Glucan) –, die ebenfalls die Gerinnungskaskade einleiten. In diesem Fall entsteht ein falsch-positives BET-Ergebnis. Auch Interferenzen wie ein schwankender pH-Wert der Probe, der etwa durch Zugabe eines sauren Mediums bei der Formulierung hervorgerufen wird, können die Genauigkeit des Endotoxin-Nachweises stören. Deshalb bietet die Fujifilm Wako Chemicals Europe GmbH, eine Schwesterfirma der US-amerikanischen Fujifilm Wako Chemicals U.S.A. Corporation, einen Endotoxin-spezifischen Puffer (ES-Puffer) an, der die Aktivierungskaskade der Pilze blockt und nur diejenige der gramnegativen Bakterien zulässt. So sind sehr präzise und quantitative Nachweise ohne falsch-positive Ergebnisse sichergestellt. Der ES-Puffer wird vor allem bei der Untersuchung von falsch-positiven Reaktionen eingesetzt, die durch das Vorhandensein von Beta-Glucanen hervorgerufen werden, und ist daher ein wertvolles Hilfsmittel für alle, die in den Bereichen Hämodialyse und pharmazeutische Qualitätskontrolle arbeiten. «Es ist bekannt, dass falsch-positive Ergebnisse bei Patienten auftreten, die sich einer Hämodialyse mit Zellulosemembranen unterziehen», so Tran. Der Puffer ist dabei für alle gängigen und unbehandelten LAL-Verfahren verschiedener Hersteller als Zusatz geeignet.
Eine Puffer-Lösung kann kleine Mengen an zugegebener Säure oder Base neutralisieren und so den pH-Wert einer Lösung stabil halten. «Damit bei unbehandelten LAL-Reagenzien der Einfluss von Beta-Glucan auf die Endotoxin-Detektion vermieden wird, enthält unser Puffer zusätzlich einen speziellen Faktor, der die Kaskade für Beta-Glucan sättigt und so den Test unempfindlich gegenüber Beta-Glucan macht», so Tran. Sofern Endotoxin vorhanden ist, wird lediglich deren Aktivität zugelassen und eine Gerinnungsreaktion ausgelöst. Der Mechanismus beruht auf einer Kaskade von zwei Serinproteasen, die als Faktor B und Faktor C bezeichnet werden. Bei Aktivierung des gerinnungsfördernden Enzyms wandeln sie das Progerinnungsenzym in seine aktive Form um, was zur Spaltung des Koagulogens in ein unlösliches Gerinnungsgel und damit zur Erhöhung der Trübung der Lösung führt. Dieser Zusammenhang macht es möglich, qualitative oder quantitative Effekte zu beobachten, also zum einen Endotoxin nachzuweisen und zum anderen auch die genaue Menge an vorhandenem Endotoxin zu bestimmen. Denn die Trübungsmessung und Farbänderung ist proportional zum Endotoxingehalt.
Die drei Methoden
Der Test selbst kann mit einer von drei Methoden durchgeführt werden: Gelgerinnung, kinetisch-turbidimetrisch (KTA) oder kinetisch-chromogen (KCA). Bei der Gelgerinnung erfolgt die Bestimmung qualitativ, das Ergebnis zeigt lediglich das Vorhandensein von Endotoxin an. Mit den kinetischen Verfahren lässt sich der Endotoxingehalt hingegen quantitativ bestimmen. Dabei kann entweder ein Mikroplatten-Reader oder ein Tube-Reader verwendet werden, um automatisch die Absorptionsänderung, die über einen bestimmten Zeitraum auftritt, photometrisch zu erfassen. Die Zeit ist dabei umgekehrt proportional zum vorhandenen Endotoxin.
Der ES-Puffer von Fujifilm Wako ist bereits für alle drei Verfahren formuliert. Jedes Fläschchen enthält eine Lösung für die Rekonstitution von 6 mL Reagenz. Die Vials sind vorgefertigt, so dass das LAL-Reagenz einfach hinein pipettiert werden kann, was zudem auch zu geringeren Kontaminationsquellen führt.
ES-Puffer bereits Bestandteil der LAL-Reagenzien
Fujifilm Wako bietet den Puffer exklusiv als einzelne Lösung zum Zusetzen unbehandelter LAL-Reagenzien an. Darüber hinaus ist der Puffer bereits Bestandteil ihrer ES-Reagenzien. «Jedes Reagenz enthält Pufferkomponenten, die dazu beitragen, die meisten Testmischungen in den pH-Bereich zu bringen, der für genaue und zuverlässige Ergebnisse erforderlich ist», erklärt Tran. «Sie können einfach mit Endotoxin-freiem Wasser ohne Bedarf an weiteren Zusätzen oder einem Puffer für die BET-Tests eingesetzt werden.» Dabei ist lediglich auf die maximal gültige Verdünnung (MVD) zu achten: Je mehr Interferenzen auftreten, desto höher muss diese ausfallen. Dank dieser effektiven Formulierung mit den enthaltenden Pufferkomponenten sind Doppel- und Dreifachbestimmungen in gleichbleibend hoher Qualität zuverlässig durchführbar.
